INTRODUÇÃO
A cromatografia de troca aniônica é uma técnica capaz de separar complexas misturas de ácidos orgânicos e ânions inorgânicos. Para amostras complexas como caldos de fermentação, o alto poder de resolução da cromatografia de troca iônica e a especificidade da condutividade suprimida permitem a determinação de ingredientes substâncias iônicas do caldo de fermentação, com pouca interferência de outros ingredientes substâncias do caldo.
Esta nota de aplicação descreve o uso de duas colunas de troca aniônica diferentes, com detecção de condutividade suprimida, para analisar ânions orgânicos e inorgânicos comuns em caldos de fermentação de leveduras e bactérias.
Nos métodos descritos nesta nota de aplicação, as seletividades do IonPac® As colunas de troca aniônica AS11 e IonPac AS11-HC são comparadas para a determinação de analitos aniônicos em caldos de fermentação.
Ambas as colunas são projetadas para separação de ânions orgânicos e inorgânicos usando gradientes de hidróxido de sódio. Os solventes orgânicos podem ser adicionados aos eluentes para modificar a seletividade dessas colunas.
METODOLOGIA
• Hidróxido de Sódio 5mM
Diluir 0,524 mL de solução de hidróxido de sódio a 50% (p /p) em 2.000 mL de água completamente desgaseificada para produzir hidróxido de sódio 5 mM. Mantenha os eluentes cobertos sob 5–8 psi (34–55 kPa) de hélio o tempo todo.
• Hidróxido de Sódio 100mM
Diluir 10,4 mL de solução de hidróxido de sódio a 50% (p / p) em 1990 mL de água completamente desgaseificada para produzir hidróxido de sódio 100 mM. Mantenha os eluentes cobertos sob 5–8 psi (34–55 kPa) de hélio o tempo todo.
• Padrões de Estoque
Os padrões sólidos foram dissolvidos em água para concentrações aniônicas de 10 g / L. Estes foram combinados e posteriormente diluídos com água para produzir as concentrações de mistura de estoque desejadas.
• Cultura de Caldo de Fermentação para Leveduras
Em um Erlenmeyer estéril de 500 mL, dissolva 10 g de Caldo BactoYPD (DIFCO Laboratories, Cat # 0428-17-5) em 200 mL de água esterilizada por filtro. O caldo Bacto YPD contém 2 g de extrato de levedura de bacto, 4 g de peptona de Bacto e 4 g de dextrose (glicose) por 10 g. Dissolver 1,0 g de levedura (S. cerevisiae; BakersYeast tipo II; Sigma Chemical Co., Cat # 45C-2) no caldo YPD.
• E. Coli Cultura de Caldo de Fermentação
O caldo LB é dissolvido a uma concentração de 25 g / L com água, aquecido até à fervura e autoclavado durante 15 minutos a 121 psi. Um litro de caldo LB contém 10 g de triptona, 5 g de extrato de levedura e 10 g de cloreto de sódio por 25 g. A cultura foi incubada e amostrada conforme descrito para o meio padrão de levedura.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
• IonPac AS11
Os ânions orgânicos e inorgânicos foram bem resolvidos. Os analitos foram eluídos da coluna em menos de 20 min.
Em geral, os ânions monovalentes eluíram primeiro, seguidos pelos ânions di e trivalentes.
• IonPac AS11 – HC
Os analitos foram eluídos usando um gradiente de hidróxido de sódio de 1–60 mM fluindo a 1,5 mL / min. Um eluente mais forte foi necessário para eluir os ânions desta coluna devido à sua maior capacidade. A capacidade mais alta melhora a resolução dos picos de eluição iniciais. Por exemplo, lactato e acetato são melhor resolvidos no AS11-HC do que no AS11. A ordem de eluição do AS11-HC é semelhante à do AS11. Estes resultados demonstram que a coluna AS11-HC tem seletividade ligeiramente diferente do AS11. Por exemplo, a coluna AS11 elui fenilacetato, brometo e nitrato vários minutos antes do malato; o AS11-HC elui esses compostos muito mais perto do malato. Além disso, o tricloroacetato elui antes do fosfato no AS11, mas elui após o pirofosfato no AS11-HC. A alta capacidade do AS11-HC permite cargas maiores de amostra.
CONCLUSÃO
Os resultados mostraram que ambos os caldos de fermentação de levedura e cultura bacteriana podem ser analisados quanto à composição de ânions usando cromatografia de íons e condutividade suprimida. Duas colunas (IonPac AS11 e AS11-HC) estão disponíveis para a análise do caldo de fermentação de ácidos orgânicos e ânions inorgânicos. O AS11-HC permite maior carregamento de amostra devido à maior capacidade. A alta capacidade da coluna é capaz de resolver lactato, acetato e formato. Misturas complexas de ânions orgânicos e inorgânicos podem ser monitoradas simultaneamente durante a fermentação, fornecendo ao analista algumas das informações necessárias para otimizar a fermentação.
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