Monitorar a entrada de leveduras selvagens e a permanência de variedades selecionadas na fermentação é fundamental para maximizar os ganhos financeiros das unidades. Formação excessiva de espuma e seus consequentes gastos com dispersantes e antiespumantes, floculação, aumento do tempo de fermentação e sobra de açúcar no vinho. Todos esses problemas provocam quedas no processo fermentativo que podem chegar a 10%, o que representa uma perda 64.000 a 80.000 L de etanol por dia, para uma destilaria que produz 800.000 L de álcool/dia. A estimativa é de um prejuízo diário de R$ 134.643,20 a R$ 168.304,00 considerando o preço do etanol anidro de R$ 2,1038 conforme indicador ESALQ/CEPEA (15-18/04/2019).
Portanto, metodologias capazes de identificar as leveduras selecionadas e distingui-las das selvagens contaminantes são as bases de um monitoramento eficaz. Atualmente, existem duas estratégias adotadas para monitorar a população de leveduras: a cariotipagem e a genotipagem. E agora, qual a estratégia será escolhida?
Cariotipagem de leveduras
Na cariotipagem é feita a análise das variações no número e tamanho de 16 cromossomos da levedura Saccharomyces cerevisiae. Por sua vez, a genotipagem adotada atualmente para o setor (existem outras variações do método) está baseada na amplificação de apenas quatro loci ou pequenas regiões do genoma da levedura. Ou seja, enquanto a cariotipagem analisa as mudanças e variações em todos os cromossomos da levedura, a genotipagem fica restrita a apenas quatro regiões (pequenos segmentos) do genoma da levedura. Isso torna a cariotipagem uma ferramenta de maior poder de resolução para distinguir diferentes cepas e avaliar suas modificações que ocorrem ao longo da safra.
Por exemplo, se uma levedura perder um pedaço do cromossomo a cariotipagem consegue identificar esta cepa como uma variante da original e diferenciá-la das selvagens, já que esta perda corresponde a 3% do material genético para as variedades diploides.
No caso da genotipagem, a mesma perda irá representar 25% do total dos loci analisados e comprometer o resultado da identificação da levedura. A dúvida poderá levar o analista a classificar a levedura como contaminante, quando na verdade ela pertence à mesma linhagem introduzida no processo, só que com uma alteração cromossômica.
Uma outra situação muito clara que demonstra as vantagens da cariotipagem sobre a genotipagem, da forma como tem sido feita atualmente, diz respeito a distinção entre leveduras Saccharomyces e não-Saccharomyces. Pela cariotipagem basta apenas um único gel e uma única analise para distinguir entre leveduras Sacharomyces e Não-Saccharomyces como mostra a Figura 1. Isso porque as leveduras do gênero Saccharomyces apresentam um número muito particular de cromossomos que as distingue das demais leveduras capazes de fermentar e tolerar teores alcoólicos acima de 8% no vinho.
Leveduras contaminantes como Dekkera bruxelensis, Schizosaccharomyces pombe, Candida krusei, Zygosaccharomyces, e outras apresentam um perfil de cromossomos extremamente diferente das Saccharomyces. Por outro lado, estas leveduras não podem ser identificadas na genotipagem porque pode ocorrer amplificação de genes semelhantes ou regiões conservadas no genoma das leveduras de gêneros tão diferentes quanto a Sacchromyces e a Candida. O analista ao observar os resultados pode interpretar a amplificação como uma linhagem de Saccharomyces, quando na verdade se trata de outro gênero completamente diferente. Da mesa forma, pode não haver amplificação do gene e levar a dúvidas sobre a identificação da levedura. Para distingui-las é necessário usar outro conjunto de primers ou recorrer a análises complementares, gerando mais custos e demandando mais tempo.
Também pesa a favor da cariotipagem o poder de resolução no que diz respeito ao número possível de combinações de cromossomos (16) contra os loci (4) usados na genotipagem. Se for considerado que cada cromossomo na levedura pode apresentar-se polimórfico, então as chances de se encontrar uma linhagem de levedura que “coincidentemente” tenha o mesmo número e tamanho de cromossomos, mas não se trata da linhagem selecionada, é da ordem de 1 em 1616 (ou 1 chance em 18.446.744.073.709.600.000). Por outro lado, se aplicarmos a mesma regra para os loci analisados pela genotipagem teríamos 1 chance em 256 de identificar uma levedura desconhecida e errar a sua identificação. Além disso, se diminuir um único locus (por não ser amplificado ou então por perda de qualidade na sua separação eletroforética) as chances caem ainda mais (1 chance em 9 apenas) o que é um risco muito grande principalmente quando há leveduras aparentadas na fermentação ou muito semelhantes entre si. Para solucionar este problema é simples. Basta aumentar o número de loci analisados na genotipagem até 16 (para se equivaler à cariotipagem). Porém, isso aumentaria o custo da genotipagem proporcionalmente ao número de loci analisados.
Finalmente, o que poderia pesar contra a cariotipagem é o fato de ser uma técnica antiga, ao contrário da genotipagem que é mais recente. Na verdade as duas técnicas nasceram na mesma época, mas a cariotipagem já tem uma longa história no monitoramento e seleção de leveduras no Brasil enquanto que a genotipagem passou a ser utilizada nos últimos quatro anos. A cariotipagem é uma técnica antiga (seus princípios foram estabelecidos em meados da década de 80), mas está em uso desde a década de 90 pela Fermentec e por outros laboratórios que trabalham com leveduras em todo mundo. Portanto, é uma técnica confiável e excelente para identificação, monitoramento e seleção de leveduras. Do contrário, teria sido abandonada ou substituída totalmente ao longo de todos estes anos.
Vantagens da cariotipagem de leveduras em relação à genotipagem:
– Maior confiabilidade nos resultados, menos chances de erros;
– Maior número de bandas polimórficas que facilitam a identificação das leveduras e o grau de parentesco com outras linhagens;
– Distinção de leveduras Saccharomyces e Não-Saccahromyces em uma única análise;
– Identificação de variantes das cepas selecionadas;
– Histórico de dados mais completo e preciso.
Fonte: www.portalft.com.br fevereiro/2015
Autores: Mario Lucio Lopes, Silene C. L. Paulillo e Henrique V. Amorim
